学习蛋白鉴定方法

与质谱(mass spectrometry)相关的技术

质谱已成为连接蛋白质与基因的重要技术,开启了大规模自动化的蛋白质鉴定之门。 用来分析蛋白质或多肽的质谱有两个主要的部分,1)样品入机的离子源,2)测量被介入离子的分子量的装置。 首先是基质辅助激光解吸附电离飞行时间质谱(MALDI-TOF)为一脉冲式的离子化技术。 它从固相标本中产生离子,并在飞行管中测其分子量。 其次是电喷雾质谱(ESI-MS),是一连续离子化的方法,从液相中产生离子,联合四极质谱或在飞行时间检测器中测其分子量。 近年来,质谱的装置和技术有了长足的进展。

在MALDI-TOF中,最重要的进步是离子反射器(ion reflectron)和延迟提取(delayed ion extraction),可达相当精确的分子量。在ESI-MS中,纳米级电雾源(nano-electrospray source)的出现使得微升级的样品在30~40 min内分析成为可能。

将反相液相色谱和串联质谱(tandem MS)联用,可在数十个picomole的水平检测;若利用毛细管色谱与串联质谱联用,则可在低picomole到高femtomole水平检测;当利用毛细管电泳与串联质谱连用时,可在小于femtomole的水平检测。甚至可在attomole水平进行。 目前多为酶解、液相色谱分离、串联质谱及计算机算法的联合应用鉴定蛋白质。 下面以肽质指纹术和肽片段的测序来说明怎样通过质谱来鉴定蛋白质。

(1)肽质指纹术(peptide mass fingerprint, PMF)

由Henzel等人于1993年提出。用酶(最常用的是胰酶)对由2-DE分离的蛋白在胶上或在膜上于精氨酸或赖氨酸的C-末端处进行断裂,断裂所产生的精确的分子量通过质谱来测量(MALDI-TOF-MS,或为ESI-MS),这一技术能够完成的肽质量可精确到0。1个分子量单位。 所有的肽质量最后与数据库中理论肽质量相配比(理论肽是由实验所用的酶来“断裂”蛋白所产生的)。配比的结果是按照数据库中肽片段与未知蛋白共有的肽片段数目作一排行榜,“冠军”肽片段可能代表一个未知蛋白。若冠亚军之间的肽片段存在较大差异,且这个蛋白可与实验所示的肽片段覆盖良好,则说明正确鉴定的可能性较大。

(2)肽片段(peptide fragment)的部分测序

肽质指纹术对其自身而言,不能揭示所衍生的肽片段或蛋白质。 为进一步鉴定蛋白质,出现了一系列的质谱方法用来描述肽片段。用酶或化学方法从N-或C-末端按顺序除去氨基酸,形成梯形肽片段(ladder peptide)。 首先以一种可控制的化学模式从N-末端降解,可产生大小不同的一系列的梯形肽片段,所得一定数目的肽质量由MALDI-TOF-MS测量。 另一种方法涉及羧基肽酶的应用,从C-末端除去不同数目的氨基酸形成肽片段。化学法和酶法可产生相对较长的序列,其分子量精确至以区别赖氨酸(128。09)和谷氨酰胺(128。06)。 或者,在质谱仪内应用源后衰变(post-source decay, PSD)和碰撞诱导解离(collision-induced dissociation, CID),目的是产生包含有仅异于一个氨基酸残基质量的一系列肽峰的质谱。因此,允许推断肽片段序列。 肽片段PSD的分析在MALDI反应器上能产生部分序列信息。首先进行肽质指纹鉴定。 之后,一个有意义的肽片段在质谱仪被选作“母离子”,在飞行至离子反应器的过程中降解为“子离子”。 在反应器中,用逐渐降低的电压可测量至检测器的不同大小的片段。但经常产生不完全的片段。 现在用肽片段来测序的方法始于70年代末的CID,可以一个三联四极质谱ESI-MS或MALDI-TOF-MS联合碰撞器内来完成。 在ESI-MS中,由电雾源产生的肽离子在质谱仪的第一个四极质谱中测量,有意义的肽片段被送至第二个四极质谱中,惰性气体轰击使其成为碎片,所得产物在第三个四极质谱中测量。与MALDI-PSD相比,CID稳定、强健、普遍,肽离子片段基本沿着酰胺键的主架被轰击产生梯形序列。连续的片段间差异决定此序列在那一点的氨基酸的质量。 由此,序列可被推测。 由CID图谱还可获得的几个序列的残基,叫做“肽序列标签”。这样,联合肽片段母离子的分子量和肽片段距N- C端的距离将足以鉴定一个蛋白质。

氨基酸组分分析

1977年首次作为鉴定蛋白质的一种工具,是一种独特的“脚印”技术。 利用蛋白质异质性的氨基酸组分特征,成为一种独立于序列的属性,不同于肽质量或序列标签。 Latter首次表明氨基酸组分的数据能用于从2-DE凝胶上鉴定蛋白质。 通过放射标记的氨基酸来测定蛋白质的组分,或者将蛋白质印迹到PVDF膜上,在155℃进行酸性水解1 h,通过这一简单步骤的氨基酸的提取,每一样品的氨基酸在40min内自动衍生并由色谱分离,常规分析为100个蛋白质/周。 依据代表两组分间数目差异的分数,对数据库中的蛋白质进行排榜,“冠军”蛋白质具有与未知蛋白质最相近的组分,考虑冠亚军蛋白质分数之间的差异,仅处于冠军的蛋白质的可信度大。 Internet上存在多个程序可用于氨基酸组分分析,如AACompIdent,ASA,FINDER,AAC-PI,PROP-SEARCH等,其中,在PROP-SEARCH中,组分、序列和氨基酸的位置被用来检索同源蛋白质。但仍存在一些缺点,如由于不足的酸性水解或者部分降解会产生氨基酸的变异。 故应联合其他的蛋白质属性进行鉴定。

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